Nouveaux greffages de capillaires pour l'analyse biopharmaceutique par CE et CE/MS

Tout afficher

Edité le 19/04/2016

Directeurs de thèse :

Prof. Hervé Cottet / Dr. Laurent Leclercq

Institut des Biomolécules Max Mousseron, UMR 5247 CNRS, Université de Montpellier, Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier, France

Envoyer un CV, une lettre de motivation et les lettre(s) de recommandation à:

herve.cottet@umontpellier.fr / laurent.leclercq@umontpellier.fr

Tel: +33 467143427 / +33 467143920

 

Description du projet :

 

La séparation et la caractérisation des protéines restent un défi analytique en analyse protéomique. Le couplage électrophorèse capillaire - spectrométrie de masse (CE-MS) est l'une des techniques adaptées à la séparation de macromolécules biologiques chargées et des protéines intactes [1-2], avec un grand nombre d'applications biopharmaceutiques [3]. La CE est notamment utilisée pour le contrôle de la pureté des protéines thérapeutiques (hétérogénéité de charge des anticorps monoclonaux) et pour la séparation d'isoformes dans les phases de développement, de formulation, d'étude de stabilité et de contrôle de la production [3]. Pour ces applications, le revêtement de la paroi interne du capillaire joue un rôle crucial afin d'obtenir des séparations efficaces (pics fins) et reproductibles [4] en évitant tout phénomène d'adsorption à la surface du capillaire. Parmi les différentes approches retenues pour prévenir de telles interactions, les systèmes multicouches de polyélectrolytes ont été introduits en 1998 [5] et développés par la suite pour des séparations notamment en milieu acide [6-7]. Néanmoins, des améliorations significatives sont possibles si l'on compare les efficacités de séparation obtenues expérimentalement à la valeur maximale théorique dans le cas d'un élargissement des pics contrôlée par la diffusion axiale.

Le but de ce projet consiste à optimiser des greffages de capillaire à base de polyélectrolytes et/ou de polyzwitterions pour la séparation par CE et CE-MS de protéines et d'anticorps monoclonaux. Cinq principaux concepts seront développés et optimisés : (i) modulation de l'écoulement électroosmotique en fonction de la nature des polyélectrolytes formant le système multicouches dans le but de proposer des solutions robustes offrant différents compromis entre la résolution des séparations et le temps d'analyse en conditions de séparation acide ou neutre/basique; (ii) étude de l'influence de la force ionique du tampon de construction des multicouches sur les performances séparatives des meilleurs couples de polyélectrolytes étudiés; (iii) nouveaux greffages par dépôt de complexes de polyélectrolytes préparés hors du capillaire en remplacement des systèmes multicouches préparés in situ dans le capillaire ; (iv) application à la caractérisation d'anticorps monoclonaux, notamment à visée oncologique, dans un tampon acide -aminocaproïque à pH 4.5, pour le contrôle de leur pureté et le suivi de leur agrégation par CE et analyse de la dispersion de Taylor [8]; (v) applications des meilleurs revêtements à l‘analyse par CE-MS de protéines et d'anticorps monoclonaux intacts et réduits. Ce dernier point sera développé et réalisé en collaboration avec le Prof. Christian Neusuess à la Faculté de Chimie de Aalen (Allemagne) lors d'un séjour de 4 mois sur la durée de la thèse.

Références bibliographiques:

[1] CE-MS for the analysis of intact proteins 2010-2012. R.  Haselberg, G. J. de Jong, G. W. Somsen. Electrophoresis 2013, 34(1):99-112.

[2] High resolution TOF MS coupled to CE for the analysis of isotopically resolved intact proteins, A. Taichrib, M. Pelzing, C. Pellegrino, M. Rossi, C. Neusüß. J. Proteomics 2011, 74, 958-966.

[3] Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. A. Staub, D. Guillarme,  J. Pharm Biomed. Anal., 2011, 55, 810-822.

[4] Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis–mass spectrometry. C. Huhn, R. Ramautar, M. Wuhrer, G. W. Somsen.  Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396, 297-314.

[5] Stable Capillary Coating with Successive Multiple Ionic Polymer Layers. H. Katayama, Y. Ishihama, N. Asakawa. Anal. Chem., 1998, 70, 2254-2260.

[6] Stability of capillaries coated with highly charged polyelectrolyte monolayers and multilayers under various analytical conditions – Application to protein analysis. R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M.-D. Blanchin, H. Fabre. J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 3537-3544.

[7] Polyelectrolyte multilayer coatings for the separation of proteins by capillary electrophoresis: influence of polyelectrolyte nature and multilayer crosslinking. S. Bekri, L. Leclercq, H. Cottet, J. Chromatogr. A., 2015, 1399, 80-87.

[8] Monitoring biopolymer degradation by Taylor dispersion analysis. J. Chamieh, J.-P. Biron, L; Cipelletti, H. Cottet, Biomacromolecules, 2015, 16, 3945-3951.

 

Title of the PhD project: New capillary coatings for biopharmaceutical CE and CE-MS applications

 

PhD supervisors:

Prof. Hervé Cottet / Dr. Laurent Leclercq

Institut des Biomolécules Max Mousseron, UMR 5247 CNRS, Université de Montpellier, Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier, France

Send a CV, a motivation letter and recommendation letter(s) to:

herve.cottet@umontpellier.fr / laurent.leclercq@umontpellier.fr

Phone numbers: +33 467143427 / +33 467143920

 

Project description:

The separation and characterization of proteins remain an analytical challenge in proteomics. The coupling between capillary electrophoresis and mass spectrometry (CE-MS) is well suited to the separation of charged biological macromolecules and intact proteins [1-2], with a strong focus on biopharmaceutical applications [3]. CE is notably used for the quality control of therapeutic proteins (charge heterogeneity of monoclonal antibodies) and for the separation of isoforms at the different stages of development, formulation, stability study and production control of biopharmaceutics. For these applications the capillary coating plays a crucial role to get efficient and reproducible separations [4], avoiding any protein adsorption phenomenon onto the capillary surface. Among the different possible approaches to avoid such undesirable interactions, polyelectrolyte multilayers have been introduced in 1998 [5] and further developed, notably for separations in acidic conditions [6-7]. Nevertheless, significant improvements are still possible if one compares the separation efficiencies obtained experimentally to the maximum theoretical value corresponding to the case of peak broadening controlled by axial diffusion.

 

The aim of this project is to optimize capillary coatings based on polyelectrolytes and/or polyzwitterions for the CE and CE/MS separations of proteins and monoclonal antibodies. Five main concepts will be developed and optimized: (i) modulation of the electroosmotic flow by changing the nature of the polyelectrolytes contained in the multilayer system to propose robust solutions offering different compromises between resolution of the separation and analysis time in acidic or basic/neutral conditions of separation; (ii) influence of the ionic strength of the multilayer construction buffer on the separation performances for the best experimented polyelectrolyte couples; (iii) new coatings based on the deposition of polyelectrolyte complexes prepared outside the capillary instead of multilayer coatings prepared in-situ in the capillary; (iv) application to the characterization of monoclonal antibodies used in oncology using a-aminocaproic acid buffer at pH 4.5 for the purity control and the monitoring of their aggregation by CE and Taylor dispersion analysis [8]; (v) application of the best coatings to the CE-MS analysis of proteins and intact or reduced monoclonal antibodies. This last study will be developed and performed in collaboration with Prof. Christian Neusuess at the Faculty of Chemistry in Aalen (Germany), on a basis of a 4 months stay in his lab. during the thesis.

 

Bibliographical references:

[1] CE-MS for the analysis of intact proteins 2010-2012. R.  Haselberg, G. J. de Jong, G. W. Somsen. Electrophoresis 2013, 34(1):99-112.

[2] High resolution TOF MS coupled to CE for the analysis of isotopically resolved intact proteins, A. Taichrib, M. Pelzing, C. Pellegrino, M. Rossi, C. Neusüß. J. Proteomics 2011, 74, 958-966.

[3] Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. A. Staub, D. Guillarme,  J. Pharm Biomed. Anal., 2011, 55, 810-822.

[4] Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis–mass spectrometry. C. Huhn, R. Ramautar, M. Wuhrer, G. W. Somsen.  Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396, 297-314.

[5] Stable Capillary Coating with Successive Multiple Ionic Polymer Layers. H. Katayama, Y. Ishihama, N. Asakawa. Anal. Chem., 1998, 70, 2254-2260.

[6] Stability of capillaries coated with highly charged polyelectrolyte monolayers and multilayers under various analytical conditions – Application to protein analysis. R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M.-D. Blanchin, H. Fabre. J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 3537-3544.

[7] Polyelectrolyte multilayer coatings for the separation of proteins by capillary electrophoresis: influence of polyelectrolyte nature and multilayer crosslinking. S. Bekri, L. Leclercq, H. Cottet, J. Chromatogr. A., 2015, 1399, 80-87.

[8] Monitoring biopolymer degradation by Taylor dispersion analysis. J. Chamieh, J.-P. Biron, L; Cipelletti, H. Cottet, Biomacromolecules, 2015, 16, 3945-3951.

 Postuler  Contact  Pièce jointe